Einzelgenanalysen

Einzelgenanalyse (Untersuchung eines einzelnen Gens) ist eine gezielte molekulargenetische Untersuchungsmethode (gezielte genetische Analyse) zur Analyse eines einzelnen krankheitsassoziierten Gens (mit einer Krankheit verbundenes Erbmerkmal) oder eines eng umschriebenen Genabschnitts (bestimmter Abschnitt der Erbinformation). Sie wird in der klinischen Labordiagnostik eingesetzt, wenn aufgrund von Phänotyp (äußere Erscheinungsmerkmale), Familienanamnese (Krankengeschichte der Familie) oder Vorbefunden ein konkretes Kandidatengen (vermutlich betroffenes Gen) mit hinreichender Vortestwahrscheinlichkeit vorliegt [1-5].

Synonyme

• Single-Gene-Testing
• Gezielte molekulargenetische Diagnostik (gezielte genetische Diagnostik)
• Kandidatengenanalyse (Untersuchung eines vermuteten Gens)
• Gerichtete Sequenzanalyse eines Einzelgens (gezielte Analyse der Erbsubstanz eines einzelnen Gens)

Das Verfahren

• Benötigtes Material
  • EDTA-Blut; üblicher Standard für die Keimbahndiagnostik (Untersuchung der vererbbaren genetischen Information)
  • Alternativ isolierte genomische DNA (isolierte Erbsubstanz)
  • Je nach Fragestellung und laborinterner Validierung auch Speichel oder Buccalschleimhautabstrich (Abstrich der Mundschleimhaut)
  • Heparinblut ist für viele molekulargenetische PCR-basierte Verfahren (Vervielfältigung von DNA im Labor) ungeeignet bzw. nachteilig und daher nicht Standardmaterial
• Vorbereitung des Patienten
  • Keine spezielle körperliche Vorbereitung erforderlich
  • Vor der Untersuchung sind Aufklärung, dokumentierte Fragestellung, schriftliche Einwilligung und die Prüfung des Beratungsbedarfs gemäß GenDG (Gendiagnostikgesetz) erforderlich
• Störfaktoren
  • Ungeeignetes Probenmaterial, unzureichende DNA-Qualität (Qualität der Erbsubstanz) oder -Menge
  • Kontamination (Verunreinigung) oder Probenverwechslung
  • Mosaikartige Varianten (genetische Veränderungen, die nur in einem Teil der Zellen vorkommen) mit niedriger Allelfrequenz (geringer Anteil der veränderten Erbinformation)
  • Allel-Drop-out (Ausfall eines Genabschnitts bei der Analyse), unzureichende Abdeckung einzelner Exons (Genabschnitte)/Regionsgrenzen, Pseudogen-Homologien (Ähnlichkeiten zu funktionslosen Genkopien)
  • Strukturelle Varianten (größere Veränderungen der Erbinformation), Repeat-Expansionen (Verlängerung sich wiederholender DNA-Abschnitte), Methylierungsstörungen (chemische Veränderungen der DNA) oder tiefe intronische Varianten (Veränderungen in nicht codierenden Genbereichen) können mit einer reinen Sequenzanalyse (Bestimmung der Basenabfolge) unentdeckt bleiben
  • Unzureichende klinische Phänotypisierung (unvollständige Beschreibung der Krankheitsmerkmale) kann die Varianteninterpretation (Bewertung genetischer Veränderungen) erheblich einschränken
• Methode
  • Heute erfolgt die Einzelgenanalyse je nach Genstruktur (Aufbau eines Gens), Variantenspektrum (Art der genetischen Veränderungen) und klinischer Fragestellung mittels Sanger-Sequenzierung (klassische Methode zur Bestimmung der DNA-Sequenz) oder gezielter Next-Generation-Sequencing (NGS)-basierter Analyse (moderne Hochdurchsatz-Sequenzierung)
  • Sanger-Sequenzierung eignet sich besonders zur Analyse kleiner Genabschnitte, zur Untersuchung bekannter familiärer Varianten (genetische Veränderungen) und zur orthogonalen Bestätigung (zusätzliche Absicherung) ausgewählter Sequenzbefunde
  • Bei größeren Genen, ausgeprägter Allelheterogenität (Vielfalt an genetischen Varianten) oder komplexerer Fragestellung kommen häufig NGS-basierte Verfahren zum Einsatz; bei Verdacht auf Deletionen/Duplikationen (Verluste oder Verdopplungen von Genabschnitten) sind ergänzende Copy-Number-Verfahren (Analyse der Anzahl von Genkopien), zum Beispiel MLPA (Multiplex-Ligation-abhängige Sondenamplifikation), erforderlich
  • Die Befundklassifikation (Einordnung der Ergebnisse) erfolgt regelhaft nach ACMG-/AMP-Kriterien (internationale Bewertungskriterien) in die Kategorien pathogen (krankheitsverursachend), wahrscheinlich pathogen, Variant unklarer Signifikanz (Bedeutung unklar), wahrscheinlich benigne (wahrscheinlich gutartig) und benigne (gutartig)
  • Die Befundinterpretation (Bewertung der Ergebnisse) muss immer im klinischen Kontext (medizinischer Zusammenhang), idealerweise unter Einbezug von Segregationsdaten (Vererbungsmuster in der Familie) und Phänotypinformationen (Krankheitsmerkmale), erfolgen

Indikationen 

• Gezielte Abklärung einer klinisch vermuteten monogenen Erkrankung (Erkrankung durch Veränderung eines einzelnen Gens) bei plausibler Gen-Phänotyp-Korrelation (Zusammenhang zwischen Genveränderung und Krankheitsbild)
• Nachweis oder Ausschluss einer bekannten familiären pathogenen Variante (krankheitsverursachende genetische Veränderung)
• Bestätigungsdiagnostik (Bestätigung einer Diagnose) bei biochemischem (Laborwerte betreffend), klinischem oder bildgebendem Hinweis auf eine definierte Erbkrankheit
• Abklärung genetisch heterogener Erkrankungen (Erkrankungen mit unterschiedlichen genetischen Ursachen), wenn ein einzelnes Gen aufgrund des Phänotyps besonders wahrscheinlich ist
• Prädiktive Testung (Vorhersageuntersuchung) nur in den gesetzlich und fachlich vorgesehenen Konstellationen nach entsprechender Aufklärung und Beratung
• Abklärung pharmakogenetisch (Einfluss von Genen auf Medikamente) oder therapeutisch relevanter Einzelgenkonstellationen, sofern hierfür eine etablierte klinische Indikation besteht

Interpretation

• Pathogene/wahrscheinlich pathogene Varianten
  • Sprechen bei passender Klinik für eine molekulargenetisch gesicherte oder hochwahrscheinliche Diagnose
  • Können diagnostische, prognostische (Verlauf betreffend), therapeutische und familiäre Konsequenzen haben
• Varianten unklarer Signifikanz
  • Erlauben keine eigenständige klinische Diagnosestellung
  • Erfordern eine Interpretation im klinischen Gesamtkontext; gegebenenfalls sind Segregationsanalysen (Untersuchung der Vererbung in der Familie), funktionelle Daten oder Re-Evaluation (erneute Bewertung) erforderlich
• Wahrscheinlich benigne/benigne Varianten
  • Sind in der Regel nicht krankheitsursächlich im Sinne der Fragestellung
• Negativer Befund
  • Schließt eine genetische Ursache nicht sicher aus
  • Mögliche Ursachen sind ein nicht erfasstes Variantenspektrum (nicht untersuchte genetische Veränderungen), ein anderes ursächliches Gen, technische Limitationen (methodische Grenzen) oder eine noch unzureichend bekannte Gen-Phänotyp-Assoziation (Zusammenhang zwischen Gen und Krankheitsbild)
• Spezifische Konstellationen
  • Bei Verdacht auf Copy-Number-Varianten (Veränderungen der Genkopienzahl), Repeat-Expansionen (Verlängerung von Wiederholungssequenzen), Mosaike (unterschiedliche Zellpopulationen), Methylierungsstörungen (chemische Veränderungen der DNA) oder komplexe strukturelle Varianten (größere Veränderungen der DNA-Struktur) sind ergänzende Spezialmethoden erforderlich
  • Bei unklarer oder breiter phänotypischer Konstellation kann ein Übergang zu Genpanel- (Untersuchung mehrerer Gene), Exom- (Untersuchung aller proteinkodierenden Gene) oder Genomdiagnostik (Untersuchung der gesamten Erbinformation) sinnvoll sein

Weiterführende Diagnostik

• Segregationsanalyse (Untersuchung der Vererbung) in der Familie
• Ergänzende Copy-Number-Analyse (Analyse der Genkopienzahl), zum Beispiel MLPA oder array-basierte Verfahren, je nach Fragestellung
• Genpanel-, Exom- oder Genomsequenzierung (erweiterte genetische Untersuchungen) bei negativem oder nicht schlüssigem Einzelgenbefund
• RNA-Analysen (Untersuchung der Boten-RNA) oder funktionelle Untersuchungen in ausgewählten Fällen
• Humangenetische Beratung (genetische Beratung) vor und nach Befundmitteilung entsprechend Indikation und Rechtsrahmen

Literatur

1. Richards S, Aziz N, Bale S, Bick D, Das S, Gastier-Foster J et al.: Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17:405-424. https://doi.org/10.1038/gim.2015.30
2. Matthijs G, Souche E, Alders M, Corveleyn A, Eck S, Feenstra I et al.: Guidelines for diagnostic next-generation sequencing. Eur J Hum Genet. 2016;24:2-5. https://doi.org/10.1038/ejhg.2015.226
3. Rehder C, Bean LJH, Bick D, Chao E, Chung W, Das S et al.: Next-generation sequencing for constitutional variants in the clinical laboratory, 2021 revision: a technical standard of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Genet Med. 2021;23:1399-1415. https://doi.org/10.1038/s41436-021-01139-4
4. Souche E, Beltran S, Brosens E, Belmont JW, Fossum M, Riess O et al.: Recommendations for whole genome sequencing in diagnostics for rare diseases. Eur J Hum Genet. 2022;30:1017-1021. https://doi.org/10.1038/s41431-022-01113-x
5. Hartley T, Lazier J, Brock JA, Caluseriu O, Chitayat D, Laberge AM et al.: Exome and genome sequencing for rare genetic disease diagnosis: a scoping review and critical appraisal of clinical guidance documents produced by genetics professional organizations. Genet Med. 2023;25:100948. doi: 10.1016/j.gim.2023.100948. Epub 2023 Aug 5.
6. Manickam K, McClain MR, Demmer LA, Biswas S, Kearney HM, Malinowski J, et al. Exome and genome sequencing for pediatric patients with congenital anomalies or intellectual disability: an evidence-based clinical guideline of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Genet Med. 2021;23:2029-2037. https://doi.org/10.1038/s41436-021-01242-6

Leitlinien

1. AWMF S2k-Leitlinie: Humangenetische Diagnostik und genetische Beratung, Registernummer 078-015; Stand 31.12.2018, gültig bis 30.12.2023, derzeit in Überarbeitung.
2. Gendiagnostikgesetz (GenDG) sowie Richtlinien der Gendiagnostik-Kommission (GEKO) als rechtlich-fachlicher Rahmen für Aufklärung, Einwilligung, ärztliche Veranlassung und genetische Beratung.