Durchflusszytometrie

Durchflusszytometrie (Zellanalyse im Flüssigkeitsstrom) ist ein multiparametrisches zellanalytisches Verfahren (Untersuchungsmethode) zur quantitativen und qualitativen Untersuchung einzelner Zellen oder Partikel in Suspension (Flüssigkeitsgemisch). Sie erfasst simultan physikalische Eigenschaften wie Zellgröße und Granularität (Körnigkeit) sowie fluoreszenzbasierte Markerexpressionen (sichtbar gemachte Erkennungsmerkmale) auf der Zelloberfläche oder intrazellulär (innerhalb der Zelle). In der klinischen Labordiagnostik (Laboruntersuchung) wird die Durchflusszytometrie vor allem zur Immunphänotypisierung (Bestimmung von Zellmerkmalen des Immunsystems) hämatologischer Neoplasien (bösartiger Erkrankungen des Blutes und blutbildenden Systems), zur Lymphozytensubtypisierung (Unterteilung bestimmter Abwehrzellen), zur Diagnostik primärer Immundefekte (angeborener Abwehrschwächen), zur Erfassung klonaler Zellpopulationen (gleichartiger Zellgruppen) und zur Verlaufs- beziehungsweise Therapiekontrolle (Behandlungskontrolle) eingesetzt [1-6].

Die Durchflusszytometrie ist kein isolierter Screeningtest (Suchtest) ohne klinische Fragestellung. Die diagnostische Aussage hängt wesentlich von Probenqualität, Antikörperpanel, Geräteeinstellung, Kompensationsstrategie, Gating (Auswahl bestimmter Zellgruppen), Referenzpopulationen (Vergleichszellgruppen) und klinischem Kontext ab [1-3].

Synonyme

• Flow Cytometry
• Multiparameter-Durchflusszytometrie
• Fluoreszenzbasierte Zellanalyse
• Durchflusszytometrische Immunphänotypisierung
• Fluorescence-activated cell analysis
• Fluorescence-activated cell sorting (FACS) – nur bei zusätzlicher Zellseparation (Zelltrennung)

Das Verfahren

• Benötigtes Material
  • EDTA-Blut – Standardmaterial für Immunstatus (Abwehrstatus), Lymphozytensubpopulationen (Untergruppen bestimmter Abwehrzellen), CD4/CD8-Monitoring, PNH-Diagnostik und viele hämatologische Fragestellungen
  • Knochenmarkaspirat (Knochenmarkprobe) – insbesondere bei akuten Leukämien (Blutkrebs), myelodysplastischen/myeloproliferativen Neoplasien, Plasmazellneoplasien und minimaler Resterkrankung (verbleibende Krankheitsreste)
  • Liquor (Nervenwasser) – bei Verdacht auf meningeale Beteiligung (Beteiligung der Hirn- und Rückenmarkshäute) hämatologischer Neoplasien; rasche Verarbeitung erforderlich
  • Bronchoalveoläre Lavage (Spülflüssigkeit aus den Atemwegen) – bei ausgewählten pneumologischen (lungenheilkundlichen) und immunologischen Fragestellungen
  • Punktate (durch Punktion gewonnene Flüssigkeiten), Ergüsse (Flüssigkeitsansammlungen), Feinnadelaspirate (mit dünner Nadel gewonnene Gewebeproben) oder Gewebesuspensionen (Gewebeaufschwemmungen) – bei Lymphomdiagnostik (Diagnostik von Lymphdrüsenkrebs) oder Nachweis klonaler Zellpopulationen
  • Stammzellpräparate – zur CD34+-Zellzählung und Produktcharakterisierung
• Vorbereitung des Patienten
  • Keine spezielle Vorbereitung erforderlich
  • Keine Nüchternblutabnahme erforderlich
  • Angabe der klinischen Fragestellung obligat, da Panelwahl und Gatingstrategie davon abhängen
  • Angabe relevanter Vortherapien erforderlich, insbesondere Glukokortikoide (Kortisonpräparate), Rituximab, andere B-Zell-depletierende Therapien (Behandlungen zur Verminderung bestimmter Abwehrzellen), Chemotherapie (Zellgiftbehandlung), Immuncheckpoint-Inhibitoren (Immunbremsen-Hemmer), CAR-T-Zelltherapie und Stammzelltransplantation (Übertragung von Stammzellen)
  • Bei hämatologischen Neoplasien möglichst Angabe von Morphologie (Zellgestalt), Blutbild, Vorbefunden, aktueller Therapie und Verdachtsdiagnose
• Störfaktoren
  • Verzögerte Probenverarbeitung – Zellverlust, Antigenmodulation (Veränderung von Erkennungsmerkmalen), unspezifische Bindung und Verlust fragiler Zellpopulationen
  • Geronnene, aggregierte (verklumpte) oder stark zellarme Proben – eingeschränkte Auswertbarkeit
  • Hämolyse (Zerfall roter Blutkörperchen) – Artefakte (Untersuchungsverfälschungen) und reduzierte Zellqualität
  • Ausgeprägte Nekrose (Gewebezerfall) oder Zellzerfall – erhöhte Hintergrundfluoreszenz (Störleuchten) und fehlerhafte Gatingergebnisse
  • Ungeeigneter Antikoagulanzientyp (Gerinnungshemmstofftyp) – methodenabhängige Einschränkung, insbesondere bei funktionellen Assays (Testverfahren)
  • Unsachgemäße Lagerung – Temperatur- und Zeitabhängigkeit der Antigenexpression (Ausprägung von Erkennungsmerkmalen)
  • Zu geringe Zellzahl – eingeschränkte Sensitivität (Empfindlichkeit), insbesondere bei Liquor, minimaler Resterkrankung und seltenen Zellpopulationen
  • Vorangegangene Antikörpertherapie – Maskierung oder Verlust diagnostisch relevanter Zielantigene (Zielerkennungsmerkmale), insbesondere CD20 nach Rituximab
  • Unspezifische Antikörperbindung – insbesondere bei aktivierten Zellen, Monozyten, toten Zellen oder hohem Immunglobulinspiegel
  • Fehlende oder unzureichende Kompensation – falsch positive oder falsch negative Fluoreszenzsignale
  • Nicht standardisierte Panels – eingeschränkte Vergleichbarkeit zwischen Laboren
• Methode
  • Zellen werden in Suspension mit fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern gegen definierte Oberflächen- oder intrazelluläre Antigene inkubiert (bebrütet).
  • Bei Vollblutproben erfolgt je nach Fragestellung eine Erythrozytenlyse (Auflösung roter Blutkörperchen); bei intrazellulären Zielstrukturen (Zielbereichen) zusätzlich Fixierung (Haltbarmachung) und Permeabilisierung (Durchlässigmachung).
  • Die Zellen passieren einzeln einen Laserstrahl; Vorwärtsstreulicht erfasst vorwiegend Zellgröße, Seitwärtsstreulicht vorwiegend Granularität und Komplexität.
  • Fluoreszenzdetektoren erfassen die Emissionssignale der verwendeten Fluorochrome (Leuchtfarbstoffe).
  • Die Auswertung erfolgt softwaregestützt durch Gating, Kompensation, Populationszuordnung und quantitative Analyse.
  • Für hämatologische Neoplasien werden standardisierte Mehrfarben-Panels, beispielsweise EuroFlow-basierte Panels, bevorzugt, wenn die Fragestellung dies erfordert [2].
  • Für seltene Ereignisse, minimale Resterkrankung und PNH-Diagnostik sind validierte Hochsensitivitätsprotokolle (besonders empfindliche Untersuchungsprotokolle), ausreichende Ereigniszahlen und interne Qualitätskontrollen erforderlich [4, 6].

Normbereiche (je nach Labor)

Normbereiche sind methoden-, alters-, material-, panel- und laborabhängig.

Indikationen (Anwendungsgebiete)

• Immunphänotypisierung bei Verdacht auf akute Leukämie
• Klassifikation akuter myeloischer Leukämien und akuter lymphatischer Leukämien in Verbindung mit Morphologie, Zytogenetik (Chromosomenuntersuchung) und Molekulargenetik (Erbgutuntersuchung)
• Abklärung lymphatischer Neoplasien, insbesondere chronisch lymphatischer Leukämie, Non-Hodgkin-Lymphomen und Plasmazellneoplasien
• Nachweis klonaler B-Zell-, T-Zell- oder Plasmazellpopulationen
• Diagnostik und Verlaufskontrolle der minimalen Resterkrankung bei ausgewählten hämatologischen Neoplasien
• Lymphozytensubtypisierung bei Verdacht auf primäre oder sekundäre Immundefekte
• Beurteilung der Immunrekonstitution (Wiederherstellung der Abwehrfunktion) nach Stammzelltransplantation, Organtransplantation oder B-Zell-depletierender Therapie
• CD4/CD8-Monitoring bei HIV-Infektion und anderen relevanten Immundefizienzkonstellationen (Abwehrschwäche-Konstellationen)
• PNH-Diagnostik durch Nachweis GPI-defizienter Erythrozyten, Granulozyten und Monozyten
• CD34+-Zellzählung bei Stammzellmobilisation (Ausschwemmung von Stammzellen), Apherese (Blutwäscheverfahren) und Stammzelltransplantation
• Liquordiagnostik bei Verdacht auf leptomeningeale Beteiligung (Beteiligung der weichen Hirn- und Rückenmarkshäute) hämatologischer Neoplasien
• Therapiemonitoring nach Antikörpertherapie, insbesondere B-Zell-Depletion nach Rituximab oder vergleichbaren anti-CD20-Therapien
• Funktionelle Immunzelltests in Speziallaboren, beispielsweise Aktivierungs-, Proliferations-, Phagozytose-, oxidative Burst- oder Apoptose-Assays
• HLA-B27-Screening in ausgewählten Laboren, sofern validiert
• Durchflusszytometrischer Crossmatch in der Transplantationsimmunologie

Interpretation

• Pathologische Befunde
  • Aberrante Antigenexpression – Hinweis auf leukämische oder lymphomatische Zellpopulation bei passendem morphologischem und klinischem Kontext
  • Leichtkettenrestriktion (einseitige Antikörper-Leichtkettenbildung) – Hinweis auf klonale B-Zell- oder Plasmazellpopulation
  • Unreife Blastenpopulation (Vorläuferzellgruppe) – Hinweis auf akute Leukämie oder andere myeloische/lymphatische Neoplasie; Linienzuordnung erfordert ein geeignetes Panel
  • Persistenz (Fortbestehen) einer aberranten Zellpopulation nach Therapie – Hinweis auf minimale Resterkrankung bei ausreichender Sensitivität und validierter Methodik
  • Verminderte oder fehlende B-Zellen – vereinbar mit primärem B-Zell-Defekt, sekundärer B-Zell-Depletion oder therapeutischem Effekt nach anti-CD20-Therapie
  • Verminderte CD4+-T-Zellen – Hinweis auf zelluläre Immundefizienz bei passender klinischer Konstellation
  • GPI-defiziente Granulozyten und Monozyten – hinweisend auf PNH-Klon
• Unauffällige Befunde
  • Ein unauffälliger durchflusszytometrischer Befund schließt eine hämatologische Neoplasie nicht sicher aus, wenn Zellzahl, Probenmaterial, Panel oder Zielpopulation nicht ausreichend geeignet sind.
  • Bei Lymphomen kann eine Gewebebiopsie (Gewebeprobe) mit Histologie (Gewebeuntersuchung), Immunhistochemie (Färbeuntersuchung von Gewebe) und molekularer Diagnostik trotz unauffälliger Durchflusszytometrie erforderlich bleiben.
  • Bei minimaler Resterkrankung bedeutet ein negativer Befund nur, dass unterhalb der validierten Nachweisgrenze keine Zielpopulation nachgewiesen wurde.
• Spezifische Konstellationen
  • Akute myeloische Leukämie – Durchflusszytometrie ist Bestandteil der initialen Diagnostik und kann für MRD-Monitoring genutzt werden; die Interpretation muss mit Zytogenetik und Molekulargenetik zusammengeführt werden [3].
  • Primäre Immundefekte – Durchflusszytometrie dient der quantitativen und funktionellen Einordnung von Immunzellpopulationen, ersetzt aber bei vielen Entitäten (Krankheitseinheiten) nicht die genetische Bestätigung [5].
  • Liquor – Aufgrund niedriger Zellzahlen ist eine rasche Verarbeitung entscheidend; negative Befunde sind bei zellarmen oder verzögert verarbeiteten Proben nur eingeschränkt belastbar [6].
  • PNH – Hochsensitive Assays mit geeigneten Granulozyten- und Monozytenmarkern sind für kleine Klone erforderlich [4].

Weiterführende Diagnostik

• Blutbild mit Differentialblutbild und mikroskopischer Ausstrichbeurteilung
• Knochenmarkzytologie (Zelluntersuchung des Knochenmarks) und Knochenmarkhistologie (Gewebeuntersuchung des Knochenmarks) bei Verdacht auf hämatologische Neoplasie
• Zytogenetik, insbesondere Chromosomenanalyse und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
• Molekulargenetische Diagnostik, insbesondere Polymerase-Kettenreaktion, Next-Generation Sequencing und krankheitsspezifische Fusionsgen- oder Mutationsanalysen
• Immunhistochemie bei Gewebeproben und Lymphknotenbiopsien
• Serumprotein-Elektrophorese, Immunfixation und freie Leichtketten bei Verdacht auf Plasmazellneoplasie
• HIV-Serologie und HIV-RNA bei entsprechender klinischer Fragestellung
• Immunglobuline, Impfantworten und Komplementdiagnostik bei Verdacht auf Immundefekt
• LDH, Harnsäure, β2-Mikroglobulin und weitere Verlaufsparameter bei hämatologischen Neoplasien
• Bildgebung bei Lymphomverdacht, insbesondere Sonographie (Ultraschalluntersuchung), Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT) oder Positronenemissionstomographie/Computertomographie (PET/CT) entsprechend Fragestellung

Klinische Hinweise

• Die Durchflusszytometrie muss immer fragestellungsbezogen angefordert werden, da die diagnostische Aussage durch die Panelauswahl bestimmt wird.
• Die Methode ersetzt keine Morphologie, Histologie, Zytogenetik oder Molekulargenetik, sondern ergänzt diese Verfahren.
• Bei hämatologischen Neoplasien ist die integrierte Befundung aus Morphologie, Immunphänotypisierung, Genetik und klinischem Verlauf entscheidend.
• Bei minimaler Resterkrankung müssen Nachweisgrenze, Sensitivität, erfasste Zellzahl und verwendete Strategie im Befund dokumentiert werden.
• Bei zellarmen Materialien wie Liquor ist die Probenlogistik ein zentraler Qualitätsfaktor.
• Standardisierte Panels und externe Qualitätssicherung verbessern Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit.

Literatur

1. Belkina AC, Roe CE, Tang VA, Back JB, Bispo C, Conway A et al.: Guidelines for establishing a cytometry laboratory. Cytometry A. 2024;105(2):88-111. https://doi.org/10.1002/cyto.a.24807
2. van Dongen JJM, Lhermitte L, Böttcher S, Almeida J, van der Velden VHJ, Flores-Montero J et al.: EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 2012;26(9):1908-1975. https://doi.org/10.1038/leu.2012.120
3. Döhner H, Wei AH, Appelbaum FR, Craddock C, DiNardo CD, Dombret H et al.: Diagnosis and management of AML in adults: 2022 ELN recommendations from an international expert panel. Blood. 2022;140(12):1345-1377. https://doi.org/10.1182/blood.2022016867
4. Sutherland DR, Illingworth A, Marinov I, Ortiz F, Andreasen J, Payne D et al.: ICCS/ESCCA consensus guidelines to detect GPI-deficient cells in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) and related disorders part 2 - reagent selection and assay optimization for high-sensitivity testing. Cytometry B Clin Cytom. 2018;94(1):23-48. https://doi.org/10.1002/cyto.b.21610
5. Kelleher P, Greathead L, Whitby L, Brando B, Barnett D, Bloxham D et al.: European flow cytometry quality assurance guidelines for the diagnosis of primary immune deficiencies and assessment of immune reconstitution following B cell depletion therapies and transplantation. Cytometry B Clin Cytom. 2024;106(6):424-436. https://doi.org/10.1002/cyto.b.22195
6. Del Principe MI, Gatti A, Johansson U, Buccisano F, Brando B. ESCCA/ISCCA protocol for the analysis of cerebrospinal fluid by multiparametric flow-cytometry in hematological malignancies. Cytometry B Clin Cytom. 2021;100(3):269-281. https://doi.org/10.1002/cyto.b.21981