Array-CGH (Array-Comparative Genomic Hybridization)

Array-CGH (Untersuchung auf kleinste Chromosomenveränderungen) (Array-Comparative Genomic Hybridization) ist ein molekularzytogenetisches Hochdurchsatzverfahren (modernes genetisches Analyseverfahren) zur genomweiten Detektion (Erkennung) von Kopienzahlveränderungen. Erfasst werden insbesondere submikroskopische Deletionen (Verluste von Erbmaterial) und Duplikationen (Verdopplungen von Erbmaterial), zusammenfassend als Copy Number Variants (CNV) bezeichnet. Die Untersuchung wird in der klinischen Labordiagnostik (Laboruntersuchung) zur Abklärung chromosomaler Imbalancen (Ungleichgewichte der Chromosomen) eingesetzt, insbesondere bei Entwicklungsstörung, Intelligenzminderung, Autismus-Spektrum-Störung, multiplen angeborenen Fehlbildungen sowie bei ausgewählten pränatalen Fragestellungen (Fragestellungen vor der Geburt) mit strukturellen fetalen Auffälligkeiten (Auffälligkeiten des ungeborenen Kindes) [1-5].

Im Unterschied zur klassischen Karyotypisierung (Chromosomenuntersuchung) erlaubt die Array-CGH eine deutlich höhere Auflösung, erkennt jedoch keine balancierten Chromosomenveränderungen (ausgeglichene Chromosomenveränderungen) ohne Kopienzahländerung, insbesondere balancierte Translokationen (Chromosomenstückverlagerungen) und Inversionen (Chromosomenstückumkehrungen). Punktmutationen (kleinste Genveränderungen), kleine Insertionen/Deletionen (Einfügungen/Verluste von Erbmaterial) unterhalb der Sondenauflösung, Repeat-Expansionen (Vermehrungen kurzer Erbgutwiederholungen), uniparentale Disomie (beide Chromosomen von einem Elternteil) und Regionen mit Verlust der Heterozygotie (Verlust genetischer Unterschiedlichkeit) werden durch die reine Array-CGH ebenfalls nicht zuverlässig erfasst. Diese Fragestellungen erfordern andere Verfahren, insbesondere Sequenzierung (Analyse der Erbgut-Bausteinfolge), MLPA, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, SNP-Array oder gezielte molekulargenetische Spezialdiagnostik [1-5].

Synonyme

• Array-Comparative Genomic Hybridization
• Array-CGH
• Array-basierte comparative genomische Hybridisierung
• Molekularer Karyotyp
• Chromosomale Microarray-Analyse, sofern Array-CGH als Plattform verwendet wird
• Mikroarray-basierte Kopienzahlanalyse

Das Verfahren

Benötigtes Material

• EDTA-Blut, in der Regel 1-2 ml, abhängig vom Labor
• Alternativ DNA aus anderem geeignetem Gewebe, z. B. Hautfibroblasten (Bindegewebszellen der Haut), wenn ein Gewebemosaik (unterschiedliche Zelllinien in einem Gewebe) oder eine blutgebundene Fragestellung vermutet wird
• Pränatal Fruchtwasser, Chorionzotten (Mutterkuchengewebe) oder fetale DNA aus geeigneten invasiv gewonnenen Proben
• Bei pränataler Diagnostik zusätzlich maternales EDTA-Blut zur Abklärung einer möglichen maternalen Zellkontamination (Verunreinigung durch mütterliche Zellen), abhängig vom Laborprotokoll

Vorbereitung des Patienten

• Keine Nüchternblutabnahme erforderlich
• Vor der Untersuchung ist eine Aufklärung über Aussagekraft, Grenzen, mögliche Nebenbefunde, Varianten unklarer Signifikanz und die Bedeutung familiärer Zusatzuntersuchungen erforderlich
• Bei pränataler Anwendung ist die Indikationsstellung streng im Kontext des Ultraschallbefundes, der Familienanamnese (Erkrankungen in der Familie) und der genetischen Beratung vorzunehmen

Störfaktoren

• Unzureichende DNA-Menge oder DNA-Qualität
• Probenverwechslung oder Kontamination
• Pränatal maternale Zellkontamination, insbesondere bei Chorionzotten oder Fruchtwasser
• Niedriggradige Mosaike (kleine Anteile genetisch unterschiedlicher Zellen) unterhalb der methodischen Nachweisgrenze
• Geringe Sondendichte in einzelnen Genomregionen mit entsprechend reduzierter lokaler Auflösung
• Benigne populationsspezifische Copy Number Variants, die eine sorgfältige Datenbank- und Kontextbewertung erfordern
• Technische Artefakte durch repetitive Sequenzen, segmentale Duplikationen oder GC-reiche Regionen
• Keine Erfassung balancierter Chromosomenveränderungen ohne Kopienzahländerung
• Keine Erfassung von Punktmutationen, kleinen Sequenzvarianten, Repeat-Expansionen und epigenetischen Veränderungen

Methode

• Patienten-DNA und Referenz-DNA werden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und gemeinsam auf einem Microarray hybridisiert
• Der Microarray enthält Sonden, die definierte Genomabschnitte repräsentieren
• Das Verhältnis der Fluoreszenzsignale zwischen Patienten-DNA und Referenz-DNA wird bioinformatisch ausgewertet
• Ein Signalabfall spricht für eine Deletion, ein Signalanstieg für eine Duplikation oder Amplifikation (Vervielfachung)
• Die genomische Position und Größe der Kopienzahlveränderung werden gegen Referenzgenome und Datenbanken abgeglichen
• Die Befundbewertung erfolgt nach standardisierten Kriterien, insbesondere unter Berücksichtigung von Geninhalt, Größe, Überlappung mit bekannten Syndromregionen, Populationsfrequenz, Vererbungsmodus, Penetranz (Wahrscheinlichkeit der Merkmalsausprägung), klinischem Phänotyp (äußeres Erscheinungsbild und Krankheitsbild) und Datenbanken wie ClinGen, DGV und DECIPHER [1-4]

Normbereiche (je nach Labor)

Normbereiche im klassischen Sinn existieren für die Array-CGH nicht. Die Befundinterpretation erfolgt qualitativ und genompositionsbezogen. Auflösung, Nachweisgrenzen und Berichtsschwellen sind labor-, plattform- und indikationsabhängig.

Indikationen (Anwendungsgebiete)

• Entwicklungsstörung unklarer Ursache
• Intelligenzminderung unklarer Ursache
• Autismus-Spektrum-Störung, insbesondere bei zusätzlichen Dysmorphien (Formauffälligkeiten), Entwicklungsstörung, Epilepsie (Anfallsleiden) oder Fehlbildungen
• Multiple angeborene Fehlbildungen
• Dysmorphiesyndrome unklarer Ätiologie (Ursache)
• Epilepsie unklarer genetischer Ursache, insbesondere bei zusätzlicher Entwicklungsstörung oder Fehlbildungen
• Wachstumsauffälligkeiten mit Verdacht auf chromosomale Imbalance
• Abklärung bekannter oder vermuteter Mikrodeletions-/Mikroduplikationssyndrome
• Abklärung familiärer pathogener oder wahrscheinlich pathogener CNV
• Pränatale Diagnostik bei einer oder mehreren strukturellen fetalen Auffälligkeiten im Ultraschall nach invasiver Probengewinnung
• Intrauteriner Fruchttod (Tod des ungeborenen Kindes in der Gebärmutter) oder Totgeburt, wenn eine chromosomale Imbalance abgeklärt werden soll und geeignetes Material vorliegt
• Ergänzende Tumorzytogenetik (Chromosomenanalyse von Tumorzellen) in ausgewählten hämatologischen oder soliden Neoplasien (Blut- oder Gewebetumoren), wenn eine genomweite Kopienzahlanalyse diagnostisch, prognostisch oder therapeutisch relevant ist

Interpretation

Pathogene oder wahrscheinlich pathogene Kopienzahlveränderungen

• Nachweis einer Deletion oder Duplikation mit etablierter Krankheitsassoziation
• Nachweis einer CNV mit relevanten Genen, bekannter Dosissensitivität (Empfindlichkeit gegenüber Gen-Dosisänderungen) oder Überlappung mit einem definierten Mikrodeletions-/Mikroduplikationssyndrom
• Abgleich mit dem klinischen Phänotyp erforderlich, da Penetranz und Expressivität (Ausprägungsstärke) variieren können
• Bei de novo nachgewiesenen pathogenen CNV ist die klinische Relevanz in der Regel höher als bei vererbten CNV mit unauffälligem Träger

Variante unklarer Signifikanz

• CNV, deren klinische Bedeutung anhand aktueller Daten nicht sicher als benign oder pathogen klassifiziert werden kann
• Häufig erforderlich sind Segregationsanalyse (Vererbungsanalyse) bei den Eltern, phänotypische Reevaluation (erneute Beurteilung des Krankheitsbildes) und gegebenenfalls spätere Reanalyse
• Eine Variante unklarer Signifikanz darf nicht isoliert als Krankheitsursache gewertet werden
• Die Befundmitteilung muss die Unsicherheit transparent darstellen

Benigne oder wahrscheinlich benigne Kopienzahlveränderungen

• CNV mit hoher Populationsfrequenz oder bekannter gutartiger Bedeutung
• In der Regel keine diagnostische Konsequenz
• Keine automatische Erklärung klinischer Symptome

Unauffälliger Befund

• Ein unauffälliger Array-CGH-Befund schließt eine genetische Erkrankung nicht aus
• Nicht erfasst werden insbesondere Sequenzvarianten, balancierte Strukturveränderungen, Repeat-Expansionen, Methylierungsstörungen (Störungen chemischer Markierungen des Erbguts), niedriggradige Mosaike und Erkrankungen ohne Kopienzahlveränderung
• Bei fortbestehendem klinischem Verdacht ist eine weiterführende genetische Diagnostik erforderlich, z. B. Exomsequenzierung, Genpaneldiagnostik, Karyotypisierung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, MLPA, SNP-Array oder Methylierungsanalyse

Spezifische Konstellationen

• Balancierte Translokation oder Inversion
  • Durch Array-CGH nicht nachweisbar, sofern keine begleitende Deletion oder Duplikation vorliegt
  • Bei Verdacht sind Karyotypisierung oder gezielte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung erforderlich
• Uniparentale Disomie oder Verlust der Heterozygotie
  • Durch reine Array-CGH nicht zuverlässig nachweisbar
  • Bei entsprechender Fragestellung ist ein SNP-Array oder eine gezielte molekulargenetische Diagnostik erforderlich
• Niedriggradiges Mosaik
  • Nachweis abhängig von Zellanteil, Gewebe, Plattform, Auswertealgorithmus und Größe der Aberration (Chromosomenabweichung)
  • Bei klinischem Verdacht kann eine Untersuchung eines zweiten Gewebes erforderlich sein

Vergleich zur klassischen Karyotypisierung

Weiterführende Diagnostik

• Elterliche Segregationsanalyse bei pathogenen, wahrscheinlich pathogenen oder unklaren CNV
• Karyotypisierung bei Verdacht auf balancierte Translokation, Inversion oder strukturelle Chromosomenumlagerung
• Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur gezielten Bestätigung oder familiären Abklärung ausgewählter Befunde
• MLPA zur gezielten Analyse einzelner Gene oder Mikrodeletions-/Mikroduplikationsregionen
• SNP-Array bei Verdacht auf uniparentale Disomie, Verlust der Heterozygotie, Konsanguinität (Blutsverwandtschaft) oder Mosaikfragestellung
• Genpaneldiagnostik oder Exomsequenzierung bei Verdacht auf monogene Erkrankung und unauffälliger Array-CGH
• Methylierungsanalyse bei Verdacht auf Imprinting-Erkrankungen (Erkrankungen durch elternabhängige Genprägung)
• Untersuchung eines zweiten Gewebes bei Verdacht auf Gewebemosaik
• Reanalyse unklarer CNV bei neuem klinischem Verlauf oder aktualisierter Datenlage

Klinische Hinweise

• Array-CGH ist bei Entwicklungsstörung, Intelligenzminderung, Autismus-Spektrum-Störung mit Zusatzbefunden und multiplen angeborenen Fehlbildungen ein etabliertes Erstlinienverfahren zur Detektion chromosomaler Imbalancen [1, 2]
• Bei pränatalen strukturellen Ultraschallauffälligkeiten liefert die chromosomale Microarray-Analyse zusätzliche diagnostische Informationen gegenüber der klassischen Karyotypisierung [1, 5]
• Die Untersuchung ist kein Ersatz für Sequenzierungsdiagnostik, wenn eine monogene Erkrankung wahrscheinlich ist
• Ein unauffälliger Befund schließt eine genetische Erkrankung nicht aus
• Varianten unklarer Signifikanz sind klinisch besonders sensibel und erfordern eine strukturierte genetische Beratung
• Die Befundbewertung muss immer phänotypbezogen erfolgen; eine CNV-Datenbankklassifikation allein ersetzt keine klinisch-genetische Interpretation
• Die Indikationsstellung zur pränatalen Array-CGH sollte restriktiv und befundorientiert erfolgen, insbesondere bei strukturellen fetalen Auffälligkeiten

Literatur

1. Shao L, Akkari Y, Cooley LD, Miller DT, Seifert BA, Wolff DJ et al.: Chromosomal microarray analysis, including constitutional and neoplastic disease applications, 2021 revision: a technical standard of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Genet Med. 2021;23(10):1818-1829. https://doi.org/10.1038/s41436-021-01214-w
2. Miller DT, Adam MP, Aradhya S, Biesecker LG, Brothman AR, Carter NP et al.: Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am J Hum Genet. 2010;86(5):749-764. https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2010.04.006
3. Riggs ER, Andersen EF, Cherry AM, Kantarci S, Kearney H, Patel A et al.: Technical standards for the interpretation and reporting of constitutional copy-number variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) and the Clinical Genome Resource (ClinGen). Genet Med. 2020;22(2):245-257. https://doi.org/10.1038/s41436-019-0686-8
4. Kearney HM, Thorland EC, Brown KK, Quintero-Rivera F, South ST; Working Group of the American College of Medical Genetics Laboratory Quality Assurance Committee. American College of Medical Genetics standards and guidelines for interpretation and reporting of postnatal constitutional copy number variants. Genet Med. 2011;13(7):680-685. https://doi.org/10.1097/GIM.0b013e3182217a3a
5. Brady PD, Delle Chiaie B, Christenhusz G, Dierickx K, Van Den Bogaert K, Menten B et al.: A prospective study of the clinical utility of prenatal chromosomal microarray analysis in fetuses with ultrasound abnormalities and an exploration of a framework for reporting unclassified variants and risk factors. Genet Med. 2014;16(6):469-476. https://doi.org/10.1038/gim.2013.168